Los miembros de la familia de proteínas BCL-2 se distinguen por la presencia de hasta cuatro dominios de homología BCL-2 diferentes (designados BH1–4).6 En términos generales, los que contienen los cuatro dominios (BCL-2, BCL-xL y MCL-1) son antiapoptóticos, mientras que los que contienen menos son proapoptóticos (Figura 2). El grupo proapoptótico se puede dividir en dos grupos, multidominios o miembros BH123, como BAX y BAK, y proteínas solo BH3, incluidas BID, BIM y PUMA, entre otras. Las proteínas BCL-2 proapoptóticas multidominio, BAX y BAK, se expresan constitutivamente y solo inducen MOMP después de estímulos apoptóticos, lo que sugiere que son inactivas en células no apoptóticas.Se requiere la activación de 7, 8 por ciertas proteínas solo BH3 para que BAX o BAK se oligomericen e inserten de forma estable en la OMM, un requisito previo importante para MOMP (a diferencia de BAX citosólico, BAK es constitutivamente mitocondrial; pero al igual que BAX, se inserta en la membrana solo tras la activación). Korsmeyer y sus colegas demostraron que las células de ratones que carecen de bax y bak son resistentes a una amplia gama de insultos proapoptóticos, lo que subraya la importancia de estas proteínas en la vía mitocondrial.9 Esto también se destaca en estudios recientes en células de doble nocaut bax/bak privadas del factor de crecimiento, donde la supervivencia se mantiene por autofagia marcada debido a la ausencia de MOMP.10 Esto sugiere que cuando se inhibe la permeabilización, las células responden manteniendo un nivel mínimo de supervivencia para ser rescatadas en caso de re-adición de factores de crecimiento o nutrientes. Por lo tanto, en ausencia de multidominios, y por lo tanto MOMP, el programa celular predeterminado es mantener la viabilidad.
La familia de BCL-2 de proteínas. La familia de proteínas BCL-2 se divide en miembros antiapoptóticos y proapoptóticos. Los miembros antiapoptóticos incluyen BCL-2, BCL-xL, A1, MCL-1 y BCL-w y contienen cuatro dominios de homología BCL–2 (designados BH1-4). Los multidominios proapoptóticos (BAX, BAK y BOK) contienen dominios BH1-3. Las proteínas solo BH3 son estructuralmente diversas y contienen solo un dominio conservado, el BH3. Las hélices alfa de cada proteína se designan y las regiones contenidas dentro de cada dominio BH se ilustran con líneas en negrita debajo de cada proteína. El dominio transmembrana carboxil terminal hidrófobo (TM) de cada proteína se basa en predicciones in silico y/o datos estructurales y no está necesariamente presente en cada miembro
Para inducir la muerte, las proteínas multidominio proapoptóticas deben ser activadas por las proteínas solo BH3 (Figura 3a). Recientemente ha surgido la hipótesis de que los miembros de la familia de proteínas solo BH3 se pueden dividir en dos grupos distintos: «activadores directos» que activan directamente BAX o BAK (Figura 3b), y «desrepresores» (o «sensibilizadores») que permiten activar BAX o BAK secuestrando proteínas antiapoptóticas como BCL-xL o MCL-1 y permitiendo la liberación posterior de activadores directos previamente inhibidos (Figura 3c).7, 11 La evidencia sugiere que las proteínas solo BH3, BID y BIM, actúan asociándose con BAX y BAK, pero esto parece ser transitorio ya que no es detectable en ausencia de detergente. Sin embargo, las proteínas antiapoptóticas, BCL-2, MCL-1 y BCL-xL, inhiben esta interacción al unirse a BID y BIM. Los otros miembros de la familia de solo BH3 (por ejemplo, Noxa, BMF, HRK, BAD y BIK) no pueden activar directamente BAX y BAK, pero pueden unirse a BCL-xL, BCL-2 y/o MCL-1 en varios grados. El modelo activador directo / despresor sugiere que estas últimas proteínas liberan BID y BIM de sus socios antiapoptóticos, lo que permite la activación de BAX y BAK de manera indirecta. Sin embargo, otra interpretación de estos resultados es que las proteínas solo BH3 funcionan para antagonizar a los miembros de la familia BCL-2 antiapoptóticos, en lugar de comprometerse con BAX o BAK.12 Esta noción explica por qué se requieren combinaciones de proteínas solo BH3 para inducir la muerte celular, ya que cada una demuestra selectividad en la unión de objetivos prosurvivales. Es importante tener en cuenta que la mayoría de la literatura sobre proteínas BH3 se basa en datos derivados del uso exclusivo del péptido BH3 de la proteína correspondiente y no en una proteína biológicamente relevante de longitud completa. Similar a una proteína de solo BH3, p53 puede funcionar para activar directamente BAX, mientras que también se ha descrito que se une a BCL-xL y BCL-2 similar a una proteína de solo BH3 de-represor.13, 14, 15 Es importante destacar que, como solo se han descrito tres proteínas activadoras directas (BID, BIM y p53), otras proteínas también pueden tener esta(s) función (s).
Dos de los mecanismos de pro-apoptóticos multidominio activación por proteínas BH3-only. a) El elemento central del MOMP es la activación y oligomerización de BAX o BAK. Estas proteínas, una vez activadas por una proteína solo BH3, son las que crean poros en la OMM que permiten la liberación de proteínas intramembranas al citosol. b) Las proteínas activadoras directas BH3, por ejemplo, BIM y BID, pueden inducir la oligomerización y activación de BAX o BAK en ausencia de otras proteínas. A través de una interacción transitoria con BAX o BAK, las proteínas activadoras directas BH3 (BID se muestra en este ejemplo), o péptidos derivados de la región BH3, inducen la liberación de MOMP y citocromo c. (c) Un subconjunto de proteínas solo BH3, los des-represores, no pueden inducir la activación de BAX o BAK solos. En este escenario, una proteína activadora directa solo BH3 es secuestrada por una proteína antiapoptótica BCL-2. Después del estrés, se induce una proteína solo BH3 despresora, ya sea por regulación al alza transcripcional o modificación post-traslacional, y esta proteína se une a una proteína BCL-2 antiapoptótica que promueve la liberación de una proteína solo BH3 activadora directa secuestrada. En este ejemplo, BIM es secuestrado por BCL-xL y la inducción de BAD permite la liberación de BIM para activar MOMP
Por lo tanto, parece haber una serie de controles y equilibrios en el citosol donde la activación de proteínas multidominio proapoptóticas no solo requiere un activador directo de proteína BH3, sino también la represión del antiapoptótico Miembros de la familia BCL-2 por proteínas solo BH3 adicionales (quizás también a través de la regulación a la baja de la transcripción o la degradación mejorada de las proteínas). Entonces, ¿qué constituye el paso de compromiso que, una vez tomado, resultará en MOMP? ¿Es la activación de BAX / BAK o la inducción de la función de proteína solo BH3? Las proteínas solo BH3 se activan en respuesta a diferentes estímulos específicos para cada miembro de la familia, y por lo tanto sus reguladores sirven como «sensores» primarios para el estrés celular. La BID se activa en la escisión por caspasa-8, granzima B y más débilmente por caspasa-2 y -3, y responde a la estimulación del receptor de muerte, la muerte citotóxica de linfocitos T y el choque térmico, respectivamente.16, 17, 18, 19, 20, 21 BIM, por otro lado, se mantiene inactivo en la célula a través de la unión a la cadena ligera de dineína-1 (DLC1) y solo puede activar multidominios al liberarse del citoesqueleto.22 Otras proteínas solo BH3, como BAD, se activan por defosforilación, mientras que PUMA y Noxa se regulan de forma transcripcional por p53 y otros estímulos proapoptóticos.23, 24 En presencia de proteínas BCL-2 antiapoptóticas, la activación de una proteína solo BH3 activadora directa generalmente no se considera suficiente para inducir MOMP, ya que será secuestrada por proteínas antiapoptóticas, y por lo tanto, también se requiere una o más de las proteínas solo BH3 despresoras. Por lo tanto, es probable que los mismos estímulos que activan BID o BIM también activen proteínas de solo BH3 de represor colateral. Por ejemplo, el FMB también se une a complejos motores de miosina (DLC2) y, por lo tanto, puede detectar cambios citoesqueléticos similares a los BIM.25 Sin embargo, la activación de proteínas solo BH3 probablemente no sea suficiente para asegurar que cada célula inicie MOMP. Este es ciertamente el caso de muchos cánceres humanos en los que el BCL-2 está sobreexpresado, lo que confiere resistencia a la quimioterapia.26 Es probable que se requieran múltiples cascadas de señalización para iniciar el MOMP, tal vez a través de los esfuerzos combinados de regulación transcripcional y modificación post-traduccional compleja (escisión, fosforilación, etc.).). Teniendo en cuenta la complejidad e irreversibilidad del MOMP, sugerimos que la activación desenfrenada de BAX o BAK es el compromiso final con la muerte celular.
MOMP: (¿Cómo) Están Realmente Involucradas las Mitocondrias?
Por definición, el MOMP ocurre en el OMM, pero esto no nos da una explicación de cómo ocurre. Hay varias formas en que las mitocondrias pueden regular su propia permeabilización y estas se originan en el IMM u OMM.
La membrana interna
La membrana interna puede causar o controlar la MOMP a través de la participación del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPT).27 El poro mPT es un complejo compuesto de varias proteínas diferentes, incluyendo VDAC (canal de aniones dependiente de voltaje), HORMIGA y ciclofilina D (cypD), que abarcan el IMMs y el OMMs donde la hormiga está en la membrana interna y el VDAC en la membrana externa (Figura 4a). La apertura de este poro permite una afluencia de iones y otras moléculas pequeñas en la matriz mitocondrial causando hinchazón de la matriz, induciendo la ruptura de la OMM y, por lo tanto, de la MOMP. El poro mPT se ha implicado como responsable de la MOMP en ciertos escenarios, incluidas las condiciones de estrés en emergencias o ROS. Se ha propuesto que durante la apoptosis inducida por estrés en la sala de Emergencias, el Ca2+ se libera de la sala de emergencias y es absorbido por las mitocondrias, lo que resulta en la liberación del citocromo c y la apoptosis. La liberación de citocromo c inducida por Ca2+de las mitocondrias parecía ocurrir en ausencia de BAX y BAK (aunque BAX y BAK pueden funcionar para controlar la liberación de Ca2+ de la sala de emergencias), lo que sugiere compromiso de poros mPT.28 Sin embargo, bajo condiciones fisiológicas, la cantidad de calcio liberada de la sala de Emergencias no es suficiente para inducir la mPT en las mitocondrias, lo que lleva a la suposición de que la mPT inducida por Ca2+ocurre en las mitocondrias que están proximales a la sala de Emergencias. Si es así, el MOMP solo debería ocurrir en estos entornos en un pequeño subconjunto de mitocondrias, una predicción que no está respaldada por observaciones directas de la liberación del citocromo c29, 30 (observaciones no publicadas).
(a) representación Esquemática de la mPT poro modelo. El poro hipotético mPT está compuesto de VDAC, HORMIGA y un número de otras proteínas. La apertura del poro permite una entrada de agua e iones en la matriz, lo que induce hinchazón y ruptura de la OMM y lo más probable es que resulte en necrosis. Se han sugerido varias proteínas para regular el mPT, incluida la hexoquinasa (HK) y el PBR. (b) Se han sugerido otras proteínas para regular el MOMP, específicamente la formación del poro BAX (o BAK), incluyendo VDAC2 y proteínas que regulan la fisión y fusión mitocondrial. Además, los componentes mitocondriales pueden inducir de forma independiente MOMP, incluyendo ROS producidos por la cadena de transporte de electrones, lo que puede causar la apertura del poro mPT, pero igualmente puede inducir apoptosis a través de la activación de proteínas solo BH3 en el citoplasma
Recientemente, varios modelos genéticos han cuestionado la importancia de mPT como inductor general de MOMP. Las HORMIGAS parecen ser prescindibles, ya que los ratones que carecen de HORMIGAS todavía pueden someterse a mPT, mientras que las células que carecen de cypD (por lo tanto, no tienen mPT) no mostraron diferencias en la apoptosis inducida por Ca2+o en una variedad de otras formas de apoptosis, aunque la necrosis inducida por Ca2+fue defectuosa.31, 32, 33 Estos resultados de los ratones Ppif KO (el gen que codifica el cypD) sugieren que la mPT puede no ser necesaria durante la apoptosis (al menos en la mayoría de los casos) y ocurre durante la isquemia y la necrosis inducida por ROS; sin embargo, el papel y el mecanismo de la muerte siguen siendo desconocidos.31 Además, como el mPT es altamente sensible a la temperatura, la liberación coordinada del citocromo c a diferentes temperaturas se opone a cualquier tipo de reacción en cadena del mPT.5, 29 Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el poro mPT, aunque importante para la muerte necrótica, puede no ser necesario para la MOMP que ocurre durante la apoptosis mitocondrial (Figura 4a).
La membrana interna puede controlar alternativamente el MOMP regulando OXFOS (fosforilación oxidativa), que a su vez regula el potencial transmembrana mitocondrial (Δψm).34 El mantenimiento de Δψm es necesario para una variedad de funciones mitocondriales, incluyendo la importación de proteínas, la producción de ATP y la regulación del transporte de metabolitos. El inicio de la MOMP a menudo se asocia con una pérdida de Δψm, pero ¿esta pérdida de Δψm induce la MOMP o ocurre como resultado de la MOMP? La interrupción del Δψm causada por la reducción incompleta del oxígeno molecular durante el OXFÓS conduce a la generación de ROS que desencadena el MOMP, pero esto puede ocurrir a través de una interacción de ROS con sensores citosólicos aún no identificados. De hecho, el ROS que se genera durante la apoptosis a menudo es causado por la escisión dependiente de caspasa de una subunidad del complejo I de la cadena respiratoria y, por lo tanto, puede ser un subproducto de MOMP en lugar de causativo.34, 35 De lo contrario, no hay evidencia convincente de que la pérdida de Δψm induce directamente el MOMP, y el OXFOS puede continuar claramente después del MOMP, ya que, en ausencia de activación de la caspasa, no solo se puede regenerar el Δψm, sino que las células también pueden mantener la producción de ATP.34, 35, 36
La membrana externa
La evidencia convincente de que la membrana interna (y de hecho la matriz) no es necesaria para el MOMP y que el MOMP solo requiere el OMM ha sido proporcionada por Kuwana et al.8 Utilizando un enfoque reduccionista para diseccionar los requisitos para la MOMP, demostraron que las vesículas unilamelares compuestas por los lípidos presentes en la membrana mitocondrial liberan su contenido en presencia de BAX activado. El uso de liposomas definidos y proteínas recombinantes de la familia BCL-2 aquí puede representar mitocondrias «simplificadas», lo que sugiere que el único requisito mitocondrial para la liberación de proteínas del espacio intermembrana es la cardiolipina, un lípido que es específico de las membranas mitocondriales. Como no se requieren otras proteínas para liberar el contenido del liposoma, estas observaciones favorecen un mecanismo de MOMP donde BAX activado (y / o BAK) forma un poro en la membrana lipídica para permitir la liberación del citocromo c. Sin embargo, este sistema de liposomas simplificado puede no reflejar con precisión la complejidad del proceso de permeabilización como ocurre en el OMM nativo y ciertos estímulos pueden requerir proteínas OMM para permitir la formación del poro BAX/lipídico. En ausencia de detergente, el BAX requiere membranas (liposomas o mitocondrias que contienen cardiolipina) para oligomerizarse y activarse, y la evidencia sugiere que el BCL-xL solo inhibirá el BAX en presencia de membranas lipídicas similares.8 Sin embargo, la importancia de la cardiolipina en este proceso también es controvertida. En la levadura, la cardiolipina no parece ser necesaria para la muerte inducida por BAX.37 Además, no se conoce la presencia o cantidad exacta de cardiolipina en la OMM y puede estar presente, en el mejor de los casos, en niveles muy bajos. Los experimentos de tinción de Inmunogold sugieren que la cardiolipina en la membrana externa se concentra en los puntos de contacto entre la IMM y la OMM donde se propone unirse a BAX/BID, y tal vez la concentración local de cardiolipina en estos sitios pueda ser lo suficientemente alta como para permitir la unión de estas proteínas.38, 39 Alternativamente, puede haber proteínas OMM que concentran cardiolipina, permitiendo la inserción de BAX y/o BAK activados en la OMM para mediar MOMP.
Existen otros dos niveles de regulación potencial en el contexto fisiológico de una OMM intacta (Figura 4b). En primer lugar, las proteínas asociadas con el OMM, además de los miembros de la familia BCL-2, pueden regular directamente el MOMP; y en segundo lugar, quizás proteínas adicionales asociadas con el OMM, también además de los miembros de la familia BCL-2, participan en el MOMP pero no regulan el proceso. Por ejemplo, muchas de las proteínas que se han descrito para regular el poro mPT también tienen afirmaciones de participar adicionalmente en MOMP. Aquí es donde surge una sutil diferencia, y tal vez, un aspecto pasado por alto de MOMP. Aunque hay numerosas proteínas en el OMM, la mayoría de ellas no son necesarias para que BAX o BAK permeabilicen las mitocondrias. Las vesículas de la membrana externa preparadas a partir de mitocondrias se permeabilizan al tratamiento con tBID similar a las mitocondrias intactas; esto debe ser independiente de la función de poros mPT, ya que están desprovistas de constituyentes de la membrana interna mitocondrial.8 Sin embargo, se especula que varias proteínas en el OMM regulan la permeabilización mediada por BAX o BAK debido a una asociación demostrada con estas últimas proteínas. Por ejemplo, BCL-2, BCL-xL, BAK y BAX han demostrado que se unen VDAC, aunque cabe señalar que como VDAC es la proteína más abundante de la OMM, la unión no puede ser fisiológica.40, 41, 42, 43 Más específicamente, Korsmeyer y sus colegas sugirieron que VDAC2 inhibe la activación de BAK al mantener BAK como un monómero en el OMM (Figura 4b).44 Si bien este puede ser el caso, es posible que VDAC2 no tome la decisión de activar o inactivar BAK, ya que en este escenario es una respuesta de señal citosólica al estrés celular, muy probablemente una proteína solo BH3, la que interrumpe la asociación VDAC2-BAK.44
De manera similar, se ha sugerido que el receptor periférico de benzodiazepinas (PBR) bloquea el MOMP.45, 46 Esta proteína de membrana integral interactúa funcionalmente con el poro mPT y es un inhibidor sugerido de MOMP. Sin embargo, los requisitos para la muerte celular todavía no cambian, tanto el estrés celular como las proteínas solo BH3 son necesarias, ya que la inhibición farmacológica simple o la interrupción de la actividad de PBR no es suficiente para que las mitocondrias emitan una señal proapoptótica; y el uso de inhibidores ciertamente puede no reflejar las funciones fisiológicas de estas proteínas.46 Tales proteínas (por ejemplo, VDAC1/2 y PBR) pueden asociarse con numerosas proteínas BCL-2, pero la señal para MOMP no puede originarse dentro de las mitocondrias; la célula debe generar un mensaje proapoptótico que se alimenta (estrés → detección celular → respuesta celular → activación de proteínas solo BH3 → activación BAX/BAK → MOMP) a la superficie mitocondrial para regular estas interacciones.
Una descripción de esta situación de «feedforward» considera el papel de AKT y hexoquinasa I/II en la prevención de la liberación de citocromo c en ciertas vías de supervivencia. La actividad de AKT parece ser necesaria para equilibrar los requisitos de absorción de glucosa y el transporte posterior de metabolitos a través de la IMM y la OMM regulando directamente la expresión y localización de la hexoquinasa en la OMM.47, 48 Curiosamente, la actividad de AKT aumentó la masa de hexoquinasa en la superficie de las mitocondrias, lo que se ha demostrado que influye dramáticamente en la actividad del canal VDAC.47 Cuando las células fueron tratadas con agentes que alteraron la asociación entre la hexoquinasa y las mitocondrias, la liberación acelerada del citocromo c se produjo solo después de un estrés proapoptótico adicional.47 Además, se ha notificado una reducción de la translocación BAX durante casos de asociación forzada de hexocinasa–mitocondrial durante el estrés.47 En conjunto, esto indica que la simple eliminación de la hexoquinasa de la OMM no es suficiente para inducir MOMP, ya que las células aún no liberan el citocromo c en ausencia de estrés, y que la señal para reclutar BAX a la OMM debe originarse fuera de las mitocondrias, independientemente de la participación de la hexoquinasa.
Otra clase importante de proteínas que residen en la OMM es responsable de la dinámica mitocondrial: las proteínas de fusión y fisión (Figura 4b). La dinámica mitocondrial es necesaria para distribuir las mitocondrias a las células hijas después de la mitosis y asegurar que la integridad mitocondrial se preserve a medida que las membranas mitocondriales se dividen y fusionan.49 Hay al menos cuatro proteínas OMM que potencialmente participan o regulan el MOMP: DRP-1 (una GTPasa relacionada con la dinamina), endofilina B1 (una transferasa lipídica necesaria para determinar la curvatura de la membrana), Fis-1 (y proteína OMM integral) y Fzo1/Nmf 1 (una GTPasa transmembrana grande).50
Hasta ahora, se ha descrito que BAX y BAK, al activarse, se unen con focos de escisión mitocondrial que están compuestos mínimamente de DRP-1 y mitofusina-2, y que BAX puede interactuar físicamente con endofilina B1 en la OMM; sin embargo, las formas dominantes negativas de DRP-1, como la DRP-1K38A deficiente en GTPasa, no bloquean la translocación de BAX después de la activación por una proteína solo BH3.51, 52, 53 Una vez más, la señal responsable de promover la translocación BAX a la OMM se genera como consecuencia del estrés celular particular (es decir, el conjunto activado de proteínas solo BH3). Pero, ¿cuál es el propósito de la interacción de BAX/BAK con esta clase de proteínas? ¿Estas proteínas simplemente participan como «puntos de acoplamiento» para BAX o BAK, o hay una regulación activa de MOMP involucrada? Tras la activación, BAX debe ser capaz de apuntar a la membrana intracelular apropiada (es decir, la OMM) para enganchar la cascada apoptótica y estas proteínas pueden servir para ‘acoplar’ BAX a la OMM. Si es verdadera, esta interpretación no podría extenderse para incluir a BAK, ya que reside constitutivamente en el OMM. Sin embargo, tal vez los reguladores de la dinámica mitocondrial (como DRP-1 o Fis-1) han evolucionado para participar en el MOMP dirigiendo la acción de BAX y BAK a la región apropiada del OMM permitiendo su actividad formadora de poros. En este escenario, la interacción propuesta no sirve por sí misma para tomar la decisión celular de inducir el MOMP, pero aún es necesaria. También se ha informado de una interacción recíproca en la que los miembros antiapoptóticos de BCL-2 promovieron la remodelación de la red mitocondrial a través de una interacción con mitofusina-2 que resultó en la fusión mitocondrial y la disminución de la sensibilidad a la muerte celular.54 En este escenario, se demostró que el CED-9, el pariente BCL-2 de Caenorhabditis elegans, podría inducir el agrupamiento mitocondrial. Reorganización mitocondrial similar también fue inducida por la expresión forzada de BCL-xL, lo que sugiere que esta actividad puede ser una función conservada de la familia BCL-2.54
Otro aspecto potencial de este escenario se relaciona con el requisito específico de lípidos para BAX (y presumiblemente, BAK) para permeabilizar una OMM. Como se mencionó anteriormente, los datos in vitro sugieren que BAX requiere cardiolipina para oligomerizar y activar la actividad formadora de poros.8 Como la cardiolipina se localiza principalmente en el IMM, ¿la maquinaria de fusión/fisión también regula el MOMP mediado por BAX creando el entorno lipídico apropiado en los sitios de contacto con DRP-1 o Fis-1? La endofilina B1, una transferasa lipídica, interactúa con BAX y puede servir para redistribuir los lípidos IMM a los sitios de contacto para la activación eficiente de BAX (y, por extensión, BAK).55, 56 Si se requiere esta actividad, la endofilina B1 puede servir como un regulador genuino de la MOMP, ya que su función necesaria puede estar sujeta a la dinámica mitocondrial y energética. El problema es si la regulación de la endofilina B1 alguna vez ayuda a determinar si y cuándo ocurrirá el MOMP.