Hanahan e Weinberg65 hanno proposto che le caratteristiche del cancro umano comprendono sei biologico competenze acquisite durante lo sviluppo del tumore, compreso il sostegno proliferativa di segnalazione, di eludere soppressori di crescita, di resistenza delle cellule morte, permettendo replicativa immortalità, l’attivazione di invasione e metastasi e indurre angiogenesi. Dato che l’espressione anormale del miRNA nei tumori, si ritiene che i miRNA disregolati potrebbero influenzare uno o più dei segni distintivi del cancro per l’iniziazione e la progressione del tumore. Secondo i loro geni dell’obiettivo, miRNA potrebbe funzionare come oncogene o soppressore del tumore in determinate circostanze.

Eludere i soppressori della crescita e sostenere la segnalazione proliferativa

La proliferazione cellulare è il segno distintivo più importante del cancro e la sua anomalia è la principale causa di tumorigenesi. In dettaglio, la progressione del ciclo cellulare è controllata da programmi intracellulari e molecole di segnale extracellulari, per raggiungere l’equilibrio tra la promozione della proliferazione cellulare e la soppressione. Le cellule diventano cancerose quando la crescita o la divisione cellulare è fuori controllo. Nel corso degli anni di studi, diventa evidente che alcuni miRNA si integrano funzionalmente in molteplici vie critiche di proliferazione cellulare e la disregolazione di questi MIRNA è responsabile di eludere i soppressori della crescita e sostenere la segnalazione proliferativa nelle cellule tumorali.

Le proteine E2F, una famiglia di fattori di trascrizione, sono regolatori critici della proliferazione cellulare in modo dipendente dal ciclo cellulare. Una serie di studi ha dimostrato che i MIRNA partecipano alla regolazione dell’espressione E2F. Il membro E2F E2F1 induce la trascrizione del gene bersaglio durante la transizione da G1 a S, 66 ed è definito come un soppressore del tumore perché i topi carenti di E2F1 hanno sviluppato un’ampia varietà di tumori. O’Donnell et al.28 ha mostrato che miR-17–92 inibisce la traduzione E2F1 dopo essere stato attivato da c-Myc. Considerando che c-Myc induce anche direttamente l’espressione di E2F1, il cluster miR-17-92 può fungere da freno a questo possibile ciclo di feedback positivo per garantire che i livelli di proteina E2F1 non aumentino precipitosamente in risposta all’attivazione di c-myc.67 Il cluster miR-17–92 è stato anche trovato per regolare la traduzione E2F2 e E2F3,68 ei fattori di trascrizione E2F possono a loro volta indurre l’espressione del cluster miR-17–92.69 Pertanto, il sistema di feedback tra il cluster miR-17–92 e E2F fornisce un meccanismo per mantenere una progressione regolare del ciclo cellulare in condizioni normali. Tuttavia, la sovraespressione di miR-17–92, che è comune tra diversi tumori, interrompe il ciclo di feedback per promuovere la proliferazione cellulare.70

La progressione del ciclo cellulare dipende da diverse cicline, chinasi ciclina-dipendenti (CDK) e dai loro inibitori, che sono ampiamente regolati dai miRNA. Hatfield et al.71 ha fornito la prima prova che le cellule staminali germinali Drosophila con knockout Dicer-1 sono bloccate nella transizione G1/S, suggerendo che i MIRNA sono necessari affinché le cellule staminali germinali superino il normale checkpoint G1/S. Inoltre, le cellule staminali germinali Dicer-carenti hanno mostrato una maggiore espressione di Dacapo, un membro della famiglia p21/p27 di inibitori Cdk, implicando che questa proteina è regolata negativamente dai miRNA per promuovere la progressione del ciclo cellulare. Infatti, miR-221/222 è stato identificato per colpire direttamente l’inibitore Cdk p27Kip1 nelle cellule di glioblastoma,72 che è stato ulteriormente confermato in altre linee cellulari tumorali e campioni tumorali primari.73-75 L’espressione ectopica di MIR-221/222 ha accelerato la proliferazione cellulare, mentre la loro soppressione ha indotto l’arresto del ciclo cellulare G1 nelle cellule tumorali. Inoltre, l’espressione di miR-221/222 è stata trovata per essere upregulated in una varietà di tumori umani, dimostrando che la regolazione di MIR-221/222 di p27Kip1 è una via oncogenica in buona fede. Simile a p27Kip1, p21CIP1 e p16INK4a sono anche regolati da miRNA come MIR-663, MIR-302 famiglia e miR-24.76,77 miR-663 è stato trovato per essere upregulated nel carcinoma nasofaringeo, e agisce come oncogene per promuovere la transizione cellulare G1/S in vitro e in vivo prendendo di mira direttamente p21CIP1. Pertanto, l’asse miR-663/p21CIP1 chiarisce il meccanismo molecolare della proliferazione cellulare del carcinoma nasofaringeo.78 Oltre ad influenzare l’espressione degli inibitori di Cdk, i MIRNA sono anche regolatori per l’espressione di Cdk e ciclina. Ad esempio, miRNA-545 porta all’arresto del ciclo cellulare nelle cellule tumorali polmonari reprimendo l’espressione della ciclina D1 e CDK4.79

I MIRNA prendono parte alla proliferazione cellulare, non solo attraverso il targeting dei componenti del ciclo cellulare, ma anche regolando estesamente più vie di segnalazione. Per esempio, miR-486, significativamente downregulated nel cancro polmonare non a piccole cellule, è stato trovato per colpire la proliferazione e la migrazione delle cellule attraverso il ricevitore della crescita dell’insulina (IGF) e le vie di segnalazione PI3K mirando IGF1, IGF1R e p85a.80

Resistere alla morte cellulare

L’evasione dell’apoptosi è un altro segno distintivo significativo della progressione tumorale, che si ritiene sia regolata dai miRNA.Le cellule tumorali 81,82 evolvono una varietà di strategie per limitare o aggirare l’apoptosi. Tra questi, la perdita della funzione soppressore del tumore p53 è più comune. I modi alternativi per eludere l’apoptosi includono l’upregulation dei regolatori anti-apoptotici, la soppressione dei fattori proapoptotici e l’inibizione della via della morte indotta dai ligandi estrinseci. I componenti coinvolti nell’anti-apoptosi sono ampiamente inibiti o attivati dai miRNA.

Un certo numero di miRNA regolati da p53 sono stati identificati per essere coinvolti nelle funzioni p53 e alcuni di questi miRNA possono modulare il livello e l’attività di p53 in un modo di feedback. Ad esempio, Pichiorri et al.83 ha identificato che nel mieloma multiplo, tre miRNA (miR-192, miR-194 e miR-215) sono attivati trascrizionalmente da p53 per sopprimere l’espressione Mdm2 tramite il legame diretto con il suo mRNA, proteggendo così p53 dalla degradazione. Questi MIRNA sono regolatori positivi di p53 e la loro downregulation ha un ruolo chiave nello sviluppo del mieloma multiplo. C’è un altro regolamento di feedback negativo, che si verifica tra miR-122 e p53. MiR-122 promuove l’attività p53 via il targeting ciclina G184 e citoplasmatica poliadenilazione elemento – binding protein,85 che aumenta la sensibilità delle cellule al farmaco doxorubicina, stabilendo una base verso lo sviluppo di chemio combinato e miRNA-based terapia per il carcinoma epatocellulare.

La disregolazione di altri miRNA regolati da p53 conferisce anche cellule tumorali resistenti all’apoptosi. Ad esempio, il cluster miR-17–92 è un nuovo obiettivo per la repressione trascrizionale mediata da p53 in condizioni di ipossia. La sua downregulation sensibilizza le cellule all’apoptosi indotta dall’ipossia, mentre la sua sovraespressione inibisce l’apoptosi. Pertanto, le cellule tumorali con aumentata espressione di miR-17–92 possono sfuggire all’apoptosi indotta dall’ipossia.86 Tutti i risultati di cui sopra hanno mostrato che p53 e i suoi miRNA regolamentati formano una rete per determinare in modo elaborato il destino delle cellule in condizioni normali. Tuttavia, le cellule tumorali con p53 disregolato o i suoi miRNA bersaglio potrebbero avere capacità di resistere alla morte cellulare.

Regolatori anti-apoptotici (Bcl-2 e Bcl-xL) e fattori proapoptotici (Bax, Bim e Puma) sono potenziali bersagli di alcuni miRNA, che hanno un ruolo importante nella morte cellulare. Come discusso sopra, miR-15a e miR-16-1 sono significativamente downregulated nella leucemia linfocitica cronica e la loro espressione è inversamente correlata con l’espressione Bcl-2. Un ulteriore studio ha dimostrato che questi due miRNA reprimono l’espressione di Bcl-2 e inducono l’apoptosi. Bcl-2 era anche regolato da altri miRNA, come miR-204,87 miR-148a88 e MIR-365.89 Denoyelle et al.90 ha scoperto che miR-491-5p induce efficacemente l’apoptosi nelle cellule tumorali ovariche inibendo direttamente l’espressione Bcl-xL e inducendo l’accumulo di Bim. MiR-221/222 inibiscono l’apoptosi cellulare mirando al gene proapoptotico PUMA nelle cellule di glioma umano. E l’abbattimento di miR-221/222 induce l’espressione di PUMA e l’apoptosi cellulare, suggerendo che miR-221/222 potrebbe essere potenziali bersagli terapeutici per l’intervento del glioblastoma.91

I MIRNA sono anche coinvolti nella resistenza alla morte cellulare regolando i componenti della via apoptotica estrinseca, come il ligando Fas/recettore Fas. MiR-21, spesso sovraregolato in una varietà di tumori, esercita una funzione anti-apoptotica nei tumori polmonari dipendenti da k-Ras inibendo l’espressione di Apaf-1, una componente importante della via apoptotica mitocondriale intrinseca e diminuendo i livelli proteici del ligando Fas, un iniziatore chiave della via apoptotica estrinseca.92 La funzione di miR-21 è stata ulteriormente confermata dall’osservazione che l’espressione ectopica di MIR-21 proteggeva le cellule tumorali dall’apoptosi indotta dalla gemcitabina.93 Shaffiey et al.94 ha identificato che miR-590 sopprime l’espressione del ligando di Fas in AML per promuovere la sopravvivenza delle cellule. Oltre a modulare l’espressione del ligando, i miRNA disregolati resistono anche alla morte cellulare regolando l’espressione dei recettori della morte. Ad esempio, Razumilava et al.95 ha scoperto che miR-25, sovraespresso nelle cellule maligne del colangiocarcinoma, è in grado di proteggere le cellule dall’apoptosi indotta da ligando legata al TNF, mirando al recettore della morte-4 (DR4).

Attivazione dell’invasione e metastasi

La metastasi è un evento biologico complesso, multistep e dinamico. La transizione epiteliale–mesenchimale (EMT) è considerata un passo iniziale e chiave nella cascata metastatica, caratterizzata dalla perdita di adesione cellulare attraverso la repressione dell’E-caderina e l’attivazione di geni associati alla motilità e all’invasione. EMT è pensato per essere regolato da una varietà di vie di segnalazione come trasformare il fattore di crescita (TGF)-β, che convergono sui fattori di trascrizione chiave come ZEB, LUMACA e torsione.96

Le evidenze crescenti mostrano che i MIRNA hanno un ruolo importante in EMT e metastasi del cancro. I miRNA regolati TGF-β sono stati trovati per impegnarsi nella segnalazione TGF-β per indurre EMT e facilitare la metastasi nella malignità avanzata. MiR-155 è uno dei MIRNA coinvolti in questo processo di regolazione. È sovraespresso in parecchi tumori maligni e trascrizionalmente attivato dalla segnalazione TGF-β/SMAD4. Gli studi meccanicistici hanno rivelato che miR-155 promuove l’EMT mirando a RhoA GTPase, un importante regolatore della polarità cellulare e della formazione e della stabilità della giunzione stretta. L’abbattimento di miR-155 sopprime l’EMT indotto da TGF-β e la dissoluzione a giunzione stretta, nonché la migrazione e l’invasione cellulare.97 In contrasto con miR-155, miR-200 e miR-203 sono inibiti da TGF-β. La famiglia miR-200 ha dimostrato di influenzare l’EMT inibendo l’espressione dei repressori trascrizionali E-caderina ZEB1 e ZEB2.98 A sua volta, la trascrizione primaria miR-200 viene anche repressa da ZEB1 e ZEB2,99 formando un ciclo di feedback doppio negativo tra ZEB1/ZEB2 e la famiglia miR-200. Questo ciclo è stato proposto per spiegare un dilemma centrale nella nostra comprensione della cascata metastatica: L’espressione di miR-200 è significativamente downregulated in cellule di cancro al seno invasive con potenziale metastatico aumentato che trasmettono un fenotipo mesenchymal. Pertanto, la sovraespressione forzata di miR-200c nelle cellule mesenchimali aumenta l’espressione di E-caderina e promuove un fenotipo epiteliale inducendo MET.100.101 Inoltre, i miRNA regolati da p53 miR-200 e miR-192 sono mediatori critici di EMT regolati da p53, supportati dall’osservazione che questi miRNA sono transattivati da p53 e modulano il programma EMT tramite la repressione dell’espressione ZEB1/2.102,103

TORSIONE e LUMACA sono gli altri due fattori chiave di trascrizione per promuovere la motilità epiteliale, invasività e metastasi attraverso la regolazione dell’espressione di alcuni miRNA. Ad esempio, miR-10b è altamente espresso nelle cellule di cancro al seno metastatico e regola positivamente la migrazione e l’invasione cellulare, che è indotta dal legame diretto di TORSIONE al presunto promotore del gene miR-10b. Inoltre, l’espressione ectopica di miR-10b nelle linee cellulari non metastatiche di cancro al seno umano SUM149 e SUM159 induce l’invasione aggressiva e la formazione di micrometastasi nei modelli murini di immunodeficienza combinata grave, fornendo una convalida sperimentale che la sovraespressione di singoli miRNA può contribuire alla formazione di metastasi in vivo.104 Inoltre, i MIRNA che regolano l’espressione di questi fattori EMT sono anche critici per il controllo delle metastasi. Per esempio, miR-203 è significativamente downregulated a causa dell’ipermetilazione del suo promotore in cellule di cancro al seno altamente metastatiche. Il ripristino di miR-203 nelle cellule di cancro al seno inibisce l’invasione delle cellule tumorali in vitro e la colonizzazione metastatica polmonare in vivo reprimendo SNAI2, suggerendo che il ciclo regolatore SNAI2 e miR-203 ha un ruolo importante in EMT e metastasi tumorali.Altri importanti MIRNA coinvolti nella regolazione delle metastasi includono miR-9 e miR-212. L’espressione MiR-9 è attivata da c-Myc e n-Myc, entrambi i quali si legano direttamente al locus miR-9-3. Il livello di espressione di miR-9 è strettamente correlato con l’amplificazione di MYCN, il grado tumorale e lo stato metastatico nei tumori del neuroblastoma. Nei tumori al seno primari di pazienti con malattia metastatica, l’espressione di miR-9 è molto più alta di quella nei pazienti senza metastasi, il che implica che miR-9 è un potenziale regolatore del processo metastatico. Ma et al. identificato che miR – 9 riduce l’espressione di E-caderina in cellule di cancro al seno via direttamente legante alla sua regione 3′-untranslate. La conseguenza della downregulation di E-cadherin da parte di miR-9 è l’attivazione della segnalazione β-catenina per innescare l’espressione di geni oncogeni a valle, che porta ad un aumento della motilità cellulare e dell’invasività. La funzione di miR-9 è ulteriormente confermata dal fatto che l’inibizione di MIR-9 utilizzando una “spugna” miRNA sopprime la formazione di metastasi nel modello animale, implicando che il silenziamento di miR-9 può rappresentare un nuovo approccio terapeutico nei tumori mammari avanzati per prevenire la formazione di metastasi.107,108 MiR-212 è significativamente downregulated nei tessuti umani di CRC dovuto sia ipermetilazione del promotore che perdita di eterozigosità. La sovraespressione di miR-212 inibisce la migrazione e l’invasione delle cellule CRC in vitro e metastasi polmonari in vivo mirando all’espressione di MnSOD, necessaria per la downregolazione dei marcatori epiteliali e l’upregolazione dei marcatori mesenchimali nelle cellule CRC. Pertanto, miR-212 potrebbe essere un marker prognostico per i pazienti con CRC per predire la loro sopravvivenza, e sia miR-212 che MnSOD potrebbero anche essere obiettivi terapeutici per il cancro.109

Indurre angiogenesi

L’angiogenesi è un processo altamente coordinato per sviluppare nuovi vasi sanguigni da quelli preesistenti per soddisfare le esigenze di cibo e ossigeno nella crescita tumorale e metastasi.110 Poiché i tessuti tumorali hanno una concentrazione di ossigeno significativamente inferiore rispetto ai tessuti normali circostanti, l’ipossia ha un ruolo critico nel microambiente tumorale consentendo lo sviluppo e il mantenimento delle cellule tumorali. Il fattore inducibile dall’ipossia (HIF) è un fattore di trascrizione chiave in risposta all’ipossia, che influenza l’espressione di un certo numero di geni, inclusi i miRNA. Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) è un fattore angiogenico fondamentale, che dirige le cellule endoteliali a costruire nuovi vasi legandosi ai suoi recettori.111 Pertanto, è probabile che i MIRNA che mirano alle vie di segnalazione HIF o VEGF abbiano un impatto significativo sull’angiogenesi. Ora è ben documentato che il processo di angiogenesi è elaborato regolato da miRNA, alcuni dei quali sono descritti in dettaglio di seguito.

MiR-210 è il miRNA più coerentemente e significativamente indotto durante l’ipossia.112 Due studi indipendenti hanno dimostrato che la sovraespressione di miR-210 nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana normossica stimola la formazione di strutture simili a capillari e la migrazione cellulare VEGF-dipendente. Al contrario, il blocco miR-210 antagonizza questi processi.113,114 Inoltre, miR-210 promuove l’angiogenesi non solo prendendo di mira il recettore tirosina chinasi ligando ephrin-A3, che è un fattore anti-angiogenico,113 ma anche migliorando l’espressione di VEGF e VEGF recettore-2 (VEGFR2).115

MiR-424 è indotto dall’ipossia nelle cellule endoteliali per promuovere l’angiogenesi in vitro e in vivo mirando alla cullina 2, una proteina di scaffold per l’ubiquitina ligasi. Questo processo stabilizza HIF1a e consente di attivare trascrizionalmente l’espressione VEGF.116 Un altro miRNA che induce l’angiogenesi è miR-21. Si rivolge PTEN per attivare le vie di segnalazione Akt/ERK a valle, portando ad alta espressione di HIF1a e VEGF.117 Al contrario, miR-20b e miR-519c regolano negativamente l’angiogenesi mirando a VEGF e/o HIF1a.118,119 Oltre a regolare HIF1a, miR-107 è stato in grado di inibire l’espressione di HIF1ß, quindi la downregolazione di miR-107 promuove l’angiogenesi tumorale in condizioni ipossiche.120

Recenti ricerche hanno dimostrato che il miRNA esosomiale delle cellule tumorali potrebbe aiutare a modulare il microambiente tumorale. Una delle prove è stata fornita da Umezu et al. Hanno osservato che miR-135b, che è sovraespresso negli esosomi da cellule di mieloma multiplo resistenti all’ipossia, sopprime l’inibizione del fattore HIF1 (FIH-1) nelle cellule endoteliali, promuovendo così la formazione del tubo endoteliale attraverso la via di segnalazione HIF-FIH. Pertanto, l’esosomiale miR-135b può essere un obiettivo per il controllo dell’angiogenesi del mieloma multiplo.121