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Il ricevitore dell’androgeno (AR) è un membro della superfamiglia nucleare del ricevitore dell’ormone steroide che include i ricevitori dell’estrogeno, della progestina, del glucocorticoide e del mineralcorticoide.1 Il legame del prototipo, endogeneously prodotto testosterone androgeno (1) e l’importante metabolita attivo diidrotestosterone (2) per AR avvia una gamma notevolmente diversificata di attività biologiche che possono variare a seconda del sesso di un soggetto, l’età e lo stato ormonale. L “attività di AR è fondamentale per il normale sviluppo sessuale umano e la funzione, ma al di là di questo ruolo firma, attivazione AR ha anche effetti importanti su diversi obiettivi come l” osso, fegato, muscoli e il sistema nervoso centrale.2,3 Il potenziale terapeutico della segnalazione degli androgeni è ben apprezzato nella comunità della chimica medicinale e per un bel po ‘ di tempo i chimici hanno cercato composti che stimolano selettivamente la crescita muscolare e ossea riducendo al minimo gli effetti proliferativi e/o ipertrofici sui tessuti sessuali come la prostata nei maschi e il clitoride nelle femmine.4,5 Tali composti sono stati definiti modulatori selettivi del recettore degli androgeni o SARMS. A questo proposito, l’androgeno prototipo ed endogeno, il testosterone, è considerato un comparatore logico di riferimento. Il composto 3 è il GTX SARM S-22 e il composto 4 è il BMS SARM 562929, entrambi i quali sono stati riportati in letteratura come composti attivi per via orale con selettività per il muscolo sulla prostata rispetto al testosterone in vari modelli preclinici.6,7

La possibilità di ottenere composti aventi attività tissutale-selettiva diversa da quella del testosterone benchmark endogeno potrebbe derivare dal fatto che l’attivazione tipica del recettore AR, che è iniziata dal legame di una molecola con affinità per l’AR al dominio di legame del ligando AR, è poi seguita da una serie piuttosto notevole e coordinata di interazioni: Questi possono includere un cambiamento nella topologia del recettore, dissociazione delle proteine da shock termico, dimerizzazione del recettore, fosforilazione del recettore, eventi di segnalazione rapida, traslocazione al nucleo (AR), associazione con molte diverse proteine coregolatorie per formare un complesso trascrizionale che si traduce nell’attivazione o soppressione della sintesi dell’RNA da geni modulati dall’AR e infine degradazione del recettore.8 Poiché ogni topologia complessa del ligando del ricevitore è unica a quella struttura del ligando, uno può apprezzare che l’interazione di tutto il complesso particolare del ligando−ricevitore con le proteine coregulatory è probabile che sia unica a quel ligando pure. Inoltre, poiché il livello di espressione di AR, la costellazione e il livello di espressione di coregulatory proteine, e gli schemi di post-trascrizionale di regolamentazione eventi differiscono in ogni tipo di androgeni cella di destinazione e la topografia di AR normativo siti nel genoma è diverso in ogni gene, questa straordinaria coreografia di eventi e le interazioni fornisce un ambiente all’interno del quale si potrebbe cercare i sarm avere un auspicabile modello di tessuto-selettiva farmacologia, come di alta anabolizzanti, ma limitata attività androgenica.

Complicando ulteriormente la nostra comprensione dell’origine della selettività SARM è la “bio-amplificazione” del testosterone androgeno endogeno primario. È interessante notare che il testosterone androgeno prodotto endogenicamente e molto importante serve come un tipo di “anti-SARM” o “SARM inverso” perché la sua attività androgenica è aumentata dalla conversione al più potente 5α-diidrotestosterone dall’enzima 5α-reduttasi in alcuni tessuti, tra cui il cuoio capelluto e della prostata (ma non nel muscolo o osso). Di conseguenza, gli androgeni che non subiscono tale bioamplificazione nella prostata dimostreranno una migliore selettività per quanto riguarda il muscolo vs prostata rispetto a un controllo trattato con testosterone o un animale intatto il cui androgeno endogeno primario è il testosterone.9 Più in generale, si potrebbe apprezzare che le differenze metaboliche tra androgeni endogeni come il testosterone o diidrotestosterone e SARMs possono anche garantire almeno alcune differenze di selettività.

Il nostro lavoro nell’area SARM ha portato alla sintesi e alla valutazione di un gran numero di modelli candidati. Mentre abbiamo trovato relativamente facile ottenere composti con alta affinità per AR, abbiamo lottato per ottenere composti che dimostrassero una buona efficacia orale e un’elevata tollerabilità in vivo. Dopo la scansione di molti potenziali lead per l’attività orale in vivo, siamo arrivati a high affinity compound 5 attraverso una combinazione di test intermedi sintetici, valutazione della letteratura e combinazione di frammenti. Siamo stati felici quando 5 ha dimostrato attività orale nei ratti.

Tuttavia, quando abbiamo eseguito un’analisi farmacocinetica nei ratti, abbiamo potuto rilevare solo livelli molto bassi di 5 dopo somministrazione orale (F< 5%). Ulteriori analisi hanno rivelato che 5 è stato convertito in modo efficiente in 6in vivo, presumibilmente dai citocromi P450 nel fegato di ratto.10 Il composto 6 aveva un’attività simile al composto 5in vivo, suggerendo che 6 era in gran parte responsabile dell’attività del composto 5.11 Uno schermo in vitro con microsomi umani ha rivelato un rapido metabolismo del composto 5, indicando così questa trasformazione come potenziale responsabilità metabolica umana e spingendoci a preparare composti in cui la posizione 4’del fenile pendente è stata bloccata dall’idrossilazione indotta da P450.12 Abbiamo esaminato diversi analoghi contenenti un gruppo di blocco 4’e nel corso dei nostri sforzi abbiamo identificato il composto 7 (RAD140; Figura Figure1)1) come il nostro candidato allo sviluppo preclinico.

Strutture di testosterone (1), 5α-diidrotestosterone (2), GTx S-22 (3), BMS 562929 (4), piombo iniziale 5, metabolita attivo 6 e 7 (RAD140).

La sintesi del composto 7 è mostrata nello schema 1.13,14 Abbiamo fatto affidamento su una rapida sostituzione ipso-fluoro del precursore sinistro, pezzo 8, con d-treonina in presenza di K2CO3 in DMSO per dare il prodotto desiderato 9 in rese lavorabili (tipicamente > 50%). Il d-Thr adduct 9 è stato accoppiato con 4-cyanobenzohydrazide in condizioni di accoppiamento standard utilizzando EDCI e HOBt. Il prodotto risultante 10 è stato sililato con TBDMS-Cl, sottoposto a condizioni di ciclizzazione deidratica in presenza di TPP / I2, e quindi desilato per la fase finale.15-17 Nel complesso, questo ha dimostrato di essere una sintesi affidabile ed efficiente utilizzando un aminoacido abbastanza economico, anche se non proteinogeno come fonte di chiralità.

la Sintesi di Composti 7 (RAD140)

La stabilità del RAD140 elevata (t1/2 > 2 h) in incubazione con ratto, scimmia, e microsomi umani, e aveva anche una buona biodisponibilità nei ratti (F = 27-63%) e scimmie (65-75%). RAD140 ha dimostrato l’affinità eccellente per il ricevitore dell’androgeno (Ki = 7 nanometro contro 29 nanometro per testosterone e 10 nanometro per DHT) come pure la buona selettività sopra altri ricevitori nucleari dell’ormone steroide, con il più vicino fuori dal ricevitore dell’obiettivo che è il ricevitore del progesterone (IC50 = 750 nanometro contro 0.2 nanometro per progesterone).L’attività funzionale dell’agonista dell’androgeno 18in vitro è stata confermata nell’analisi di differenziazione dell’osteoblasto C2C12, dove un EC50 di 0.1 nM è stato indicato (DHT = 0.05 nM).19

RAD140 è stato caratterizzato in una serie di saggi in vivo per determinare la sua efficacia orale su una serie di parametri associati all’attività androgenica in modelli preclinici. Ad esempio, RAD140 è stato dosato in ratti maschi giovani castrati e intatti al fine di valutare i suoi effetti attraverso una gamma di sfondi di segnalazione androgeni endogeni. Il giovane ratto castrato fornisce un saggio in vivo molto sensibile per l’attività androgenica perché l’animale è relativamente naïve agli androgeni; quindi, qualsiasi attività di segnalazione da un androgeno somministrato esogeno si sovrappone a uno sfondo essenzialmente vuoto.20 In Figura Figure2,2, l’effetto di aumentare le dosi di RAD140 somministrato per via orale (0.5% metilcellulosa) su levator ani bulbocavernosus muscle (”levator ani “o” LABC”) peso e peso della prostata è mostrato rispetto al veicolo (controllo castrato), sham (controllo non castrato) e propionato di testosterone (TP) dosato per via sottocutanea a 1 mg/kg in olio di mais.21 Come si può vedere, RAD140 stimola il muscolo ani levatore a partire da una dose di 0,03 mg/kg (po) e raggiunge un livello di efficacia equivalente all’animale finto operato a 0,3 mg/kg.

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Attività agonista tessuto-selettiva di RAD140 in ratti immaturi castrati. I pesi muscolari (levator ani) e prostatici degli animali trattati per 11 giorni sono tracciati con controlli fittizi e veicoli insieme alla SD. TP è testosterone propionato dosato per via sottocutanea ogni giorno in olio di mais. Cinque ratti sono stati inclusi in ciascun gruppo di trattamento. * p< 0.05 vs veicolo per la prostata. §p< 0.05 vs veicolo per LABC.

Perché siamo costantemente osservato che RAD140 non è riuscito a raggiungere un livello di prostata o delle vescicole seminali stimolazione pari a TP a 1 mg/kg (non importa quanto in alto la dose di RAD140), abbiamo deciso di verificare se RAD140 potrebbe antagonizzare l’effetto di TP su ratto della prostata e le vescicole seminali e, allo stesso tempo, determinare gli effetti che la somministrazione concomitante di RAD140 e TP potrebbe avere sul ani di levator. Dai risultati mostrati nella figura Figure3,3, è evidente che una dose elevata di RAD140 (10 mg/kg, po) in realtà antagonizza l’effetto di TP a 1 mg/kg sulle vescicole seminali ma aggiunge l’effetto di TP sul muscolo ani levatore. Siamo stati in grado di accertare che la dose efficace per raggiungere l’antagonismo di RAD140 è 0,3−1 mg/kg (po) per 1 mg/kg TP (sc) (dati non mostrati). Nella prostata, RAD140 ha anche causato una tendenza al ribasso nella stimolazione da parte di TP, ma il cambiamento non ha raggiunto la significatività statistica. Così, nel giovane modello maschio del ratto del castrato, RAD140 sembra essere un agonista potente e completo dell’androgeno sull’ani del levator, ma un antagonista più debole e parziale sulla vescicola seminale ed eventualmente sulla prostata.22

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Attività antagonista selettiva del tessuto di RAD140. Il muscolo (levator ani), le vescicole seminali ed i pesi della prostata dai ratti immaturi castrati trattati per 11 giorni sono tracciati come percentuale del proponiato del testosterone (TP) insieme alla SD. * p < 0.05 vs TP per tutti i tessuti.

L’obiettivo della maggior parte dei modelli preclinici in vivo è quello di prevedere al meglio le prestazioni di un farmaco nella popolazione target. Quando si considera il problema di come stimolante un androgeno è su un dato tessuto in un modello preclinico, si dovrebbe tenere a mente che il livello di fondo di androgeni segnalazione può influenzare la risposta osservata in un animale. Il modello castrato del ratto ha limitazioni perché il livello endogeno molto basso dell’androgeno in questo modello è una situazione artificiale, non riflessa nella popolazione maschio umana adulta dell’obiettivo.23 In particolare, la popolazione maschile target avrà un background androgenico ben al di sopra di un castrato, anche se i livelli di androgeni saranno probabilmente inferiori alla norma per il loro gruppo.

Per capire meglio come questo gruppo potrebbe rispondere, abbiamo deciso di guardare i giovani ratti maschi intatti, dal momento che hanno testosterone endogeno ma a livelli un po ‘ ridotti. Di conseguenza, mantengono la sensibilità della prostata ad un composto androgeno ma allo stesso tempo hanno una stimolazione della linea di base che è più simile alla popolazione dell’obiettivo che gli animali castrati. Come mostrato nella figura Figure4,4, RAD140 ha aumentato il peso del muscolo levatore ani sopra quello del controllo intatto a partire dalla dose più bassa testata (0,1 mg/kg). È interessante notare che RAD140 non ha dimostrato alcuna stimolazione della prostata al di sopra del livello di controllo animale intatto fino alla dose più alta testata, 30 mg/kg. A 0,3 mg/kg, RAD140 ha dimostrato un’efficacia muscolare simile a TP a 0,5 mg / kg, ma è stata necessaria una dose di 30 mg/kg di RAD140 per approssimare l’efficacia prostatica di 0,5 mg/kg TP.24 Da questo studio è evidente che nei giovani ratti maschi intatti RAD140 ha una gamma molto ampia di selettività rispetto sia ai ratti trattati con TP che ai ratti sham-control.

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Attività agonista tissutale selettiva di RAD140 in giovani ratti maschi intatti. Il muscolo (levator ani) e i pesi della prostata da ratti immaturi intatti trattati per 11 giorni sono tracciati con controlli fasulli e veicoli insieme alla SD. Otto ratti sono stati inclusi in ciascun gruppo di trattamento. * p< 0.05 vs veicolo per la prostata. §p< 0.05 vs veicolo per LABC.

Infine, eravamo interessati a valutare l’effetto di RAD140 in giovani scimmie cynomolgous maschili per stabilire livelli di dosaggio efficaci in quella che consideravamo una specie preclinica più rilevante. Abbiamo eseguito uno studio relativamente semplice, nonterminale che ancora ci ha permesso di valutare anabolizzanti e lipidi e altri parametri di chimica clinica. Per valutare l’attività anabolica, abbiamo prima esaminato il peso corporeo lordo, che sapevamo essere un marker sensibile dell’azione anabolica degli androgeni nei giovani primati non umani. I risultati sul peso corporeo dell’animale di 28 giorni di dosaggio con RAD140 a 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg e 1 mg/kg sono mostrati nella figura Figure55.

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Primate peso corporeo dal giorno -21, attraverso 28 giorni di dosaggio e 21 giorni postdosing con RAD140 (0.01, 0.1, e 1 mg / kg, po).25 Tre scimmie sono state incluse per ogni gruppo di trattamento. La variazione del peso corporeo sottratto al basale dal giorno -1 al giorno 29 è stata statisticamente significativa per lo 0.solo 1 mg/kg (p < 0,01) e 1,0 mg/kg (p < 0,05). La variazione del peso corporeo al giorno 29 tra il gruppo di 0,1 mg/kg e il gruppo di 0,01 mg/kg è stata statisticamente significativa (p < 0,05) ma non per 1,0 mg/kg e il gruppo di 0,01 mg/kg (p < 0,1).

A causa della piccola dimensione del gruppo (n = 3 per ogni gruppo di dosaggio), abbiamo usato il cambiamento di peso di fondo di ciascun animale per le settimane precedenti l’esperimento per stabilire la linea di base come controllo. Poiché il peso corporeo medio per ogni gruppo di tre scimmie convergeva in un numero quasi identico (giorno -1), con l’intervallo di peso corporeo assoluto tra i gruppi di soli 4,26−4,29 kg, abbiamo tracciato il peso corporeo assoluto nella figura Figura5.5. In questo studio, è stato raggiunto un aumento medio di peso superiore al 10% in soli 28 giorni di somministrazione ad una dose di soli 0,1 mg/kg, con un effetto simile osservato nel gruppo di dosaggio di 1,0 mg/kg.26

La scansione a raggi X a doppia energia (“DEXA”) di tutte le scimmie è stata effettuata due giorni prima dell’inizio della somministrazione e un giorno dopo la dose finale (giorno -2 e giorno 29) al fine di determinare gli effetti di RAD140 sul tessuto magro e sul grasso; i risultati sono mostrati nella figura Figure6.6. Come si può vedere, non vi è stato alcun effetto coerente sulla massa grassa assoluta, mentre il muscolo ha mostrato una tendenza qualitativa che aumenta con la dose. Anche se sembra che la maggior parte dell’aumento di massa mostrato nella figura Figure55 fosse dovuto all’aumento della massa magra, nessuno degli aumenti del peso del tessuto era abbastanza statisticamente significativo (p > 0.05), che potrebbe essere dovuto alle piccole dimensioni del gruppo (n = 3) e alle deviazioni standard relativamente grandi.27

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Variazione media del peso del tessuto primate misurata mediante analisi DEXA al giorno -2 e al giorno 29. Deviazione standard per grasso (36, 36, 40) e tessuto magro (65, 205, 188) per 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg e 1,0 mg/kg, rispettivamente. Nessuna delle modifiche è stata statisticamente significativa (p > 0,05).

La chimica clinica ha indicato il previsto abbassamento dei lipidi (LDL, HDL, trigliceridi).Nonostante gli aumenti piuttosto drammatici del peso corporeo in un tempo così breve, non vi è stato alcun aumento dei livelli di transaminasi degli enzimi epatici in nessun animale a qualsiasi dose >2 volte rispetto al suo valore basale.29,30 Data la consolidata relazione tra l’uso orale di androgeni e gli indicatori di stress del fegato, siamo stati molto contenti che a una dose 10 volte superiore alla dose pienamente efficace abbiamo visto aumenti minimi degli enzimi epatici.31Taken in somma, RAD140 ha tutte le caratteristiche di un SARM. È la potenza selettiva, poiché stimola gli aumenti di peso muscolare ad una dose inferiore a quella necessaria per stimolare gli aumenti di peso della prostata. Inoltre, è anche efficacia selettiva, perché è completamente anabolizzanti sul muscolo, ma dimostra meno completa efficacia sulla prostata e vescicole seminali e, infatti, può parzialmente antagonizzare la stimolazione delle vescicole seminali indotta da testosterone. RAD140 ha un’eccellente farmacocinetica ed è un potente anabolizzante anche nei primati non umani. Crediamo che il profilo preclinico complessivo di RAD140 sia molto buono e che il composto abbia completato la tossicologia preclinica sia nei ratti che nelle scimmie. Attualmente stiamo preparando RAD140 per gli studi clinici di fase I in pazienti affetti da grave perdita di peso a causa della cachessia del cancro.

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