To av de mest spennende og allsidige genetiske verktøy utviklet i de siste 30 årene Er Cre-lox og FLP-FRT teknologier. Begge tillater plasseringen og tidspunktet for genuttrykk å være nøye regulert. Denne artikkelen beskriver kort hvordan de to systemene fungerer og kan brukes i musemodeller.
Cre-lox-systemet
Cre-lox-teknologien ble introdusert på 1980-tallet (Sauer Og Henderson 1988; Sternberg og Hamilton 1981) og patentert av DuPont Pharmaceuticals. Det har blitt brukt i gjær, planter, pattedyrcellekulturer og mus(Araki et al. 1987). Det er basert på evnen Til p1 bacteriophage cyclisation rekombination (Cre) rekombinase gen (cre) for å påvirke rekombinasjon mellom par av loxP steder. Slike rekombinasjon i en» Cre-lox » mus (se nedenfor) kan enten aktivere eller inaktivere et gen av interesse.for å bruke Cre-lox-teknologi må en etterforsker produsere En Cre-lox-mus, vanligvis ved å avle En Cre-mus til en loxP-mus. En Cre mus inneholder en cre rekombinase transgen under retning av en vevsspesifikk promoter; en loxP mus inneholder to loxP områder som flankerer en genomisk segment av interesse, den» floxed » locus. Vanligvis produseres Cre-og loxP-mus ved hjelp av transgen teknologi (Nagy 2000). Avhengig av promotorer og andre regulatoriske kontroller som brukes til å konstruere dem, Kan Cre-mus kun utformes for å uttrykke cre rekombinase under visse forhold, inkludert følgende: i visse vev, når en mus diett er supplert med stoffer som doksycyklin, tetracyklin, RU486 og tamoxifen (Brocard et al. 1998; Kellendonk et al. 1999; Utomo et al. 1999) og under visse utviklingsstadier. Avhengig av plasseringen og orienteringen til loxP-stedene i En Cre-lox-mus, Kan Cre rekombinase initiere slettinger, inversjoner og translokasjoner av floxed locus (Nagy 2000) (Fig. 1).
Fig. 1.
Cre-lox reaksjoner påvirkes av orientering og plassering av loxP nettsteder. Parede loxP-steder (trekanter) har retningsmessighet og kan plasseres i en cis (samme DNA-streng) eller trans (forskjellige DNA-tråder) arrangement. (A) hvis loxP-områdene flankerer ET DNA-segment (rektangel) i et cis-arrangement og er orientert i samme retning, medierer cre rekombinase eksisjon eller sirkularisering av segmentet. (B) hvis loxP-områdene flankerer DNA-segmentet i et cis-arrangement og er orientert i motsatt retning, medierer Cre rekombinase inversjonen av segmentet. (C) hvis loxP-områdene ligger på forskjellige tråder AV DNA og er orientert i samme retning, formidler Cre rekombinase en translokasjon av segmentet.
vanligvis utvikles Cre-og loxP-stammer uavhengig og krysses deretter. Mange Forskjellige Cre-stammer, som hver inneholder Et cre-transgen under retning av en annen vevsspesifikk promotor, kan krysses med en enkelt loxP-stamme. Avhengig av hvilke stammer som er parret, kan En rekke Cre-medierte modellsystemer konstrueres, inkludert transgenikk, knockouts, hypomorphs, repairable hypomorphs, kromosomavvik og diettinducerte mutanter. Ved å blande Og matche Cre-og loxP-stammer, kan en etterforsker studere et gens effekter på vevsspesifikke og utviklingsstadiumspesifikke måter som tidligere var umulige.
FLP-FRT-systemet
FLP-FRT-systemet ligner På Cre-lox-systemet og blir stadig mer brukt i musebasert forskning. Det innebærer bruk av flippase (FLP) rekombinase, avledet fra gjær Saccharomyces cerevisiae (Sadowski 1995). FLP gjenkjenner ET PAR FLP rekombinase mål (FRT) sekvenser som flankerer en genomisk region av interesse.
Araki K, Imaizumi T, Okuyama K, Oike Y, Yamamura K. 1997. Effektivitet av rekombinasjon Ved cre forbigående uttrykk i embryonale stamceller: sammenligning av ulike promotorer. J Biochem (Tokyo) 122: 977-82.Brocard J, Feil R, Chambon P, Metzger D. 1998 en kimær Cre rekombinase induserbar av syntetisk, men ikke av naturlige ligander av glukokortikoidreseptoren. Nukleinsyrer Res 26:4086-90.
JAX NOTATER. 1999. NIH, Jackson Laboratory og Dupont Pharmaceuticals signere Cre-lox teknologi bruker avtaler. JAX NOTATER 476: 4.Kellendonk C, Tronche F, Reichardt HM, Schutz G. 1999. Mutagenese av glukokortikoidreseptoren hos mus. J Steroid Biochem Mol Biol 69:253-9.
Nagy a. 2000. Cre rekombinase: det universelle reagenset for genom skreddersy. Første mosebok 26: 99-109.
Sadowski S. 1995. Flp-rekombinasen av 2-µ plasmid Av Saccharomyces cerevisiae. Prog Nukleinsyre Res Mol Biol 51:53-91.
Sauer B, Henderson N. 1988. Stedsspesifikk DNA-rekombinasjon i pattedyrceller ved Rekombinase av cre av bakteriofag P1. Proc Natl Acad Sci U S A 85:5166-70.
Sternberg N, Hamilton D. 1981. Bakteriofag P1 stedsspesifikk rekombinasjon. I. Rekombinasjon mellom loxP nettsteder. J Mol Biol 150: 467-86.
Utomo AR, Nikitin AY, Lee WH. 1999. Temporal, romlig og celletypespesifikk kontroll av Cre-mediert DNA rekombinasjon i transgene mus. Nat Biotechnol 17:1091-6.