două dintre cele mai interesante și versatile instrumente genetice proiectate în ultimii 30 de ani sunt tehnologiile Cre-lox și FLP-FRT. Ambele permit localizarea și calendarul expresiei genelor să fie reglate îndeaproape. Acest articol prezintă pe scurt modul în care funcționează cele două sisteme și pot fi utilizate în modelele de mouse.
sistemul Cre-lox
Tehnologia Cre-lox a fost introdusă în anii 1980 (Sauer și Henderson 1988; Sternberg și Hamilton 1981) și brevetată de DuPont Pharmaceuticals. A fost aplicat cu succes în drojdii, plante, culturi de celule de mamifere și șoareci (Araki și colab. 1987). Se bazează pe capacitatea genei de recombinază a ciclizării bacteriofagului P1 (Cre) (cre) de a efectua recombinarea între perechi de situsuri loxP. O astfel de recombinare într-un șoarece” Cre-lox ” (vezi mai jos) poate activa sau inactiva o genă de interes.
pentru a utiliza tehnologia Cre-lox, un investigator trebuie să producă un șoarece Cre-lox, de obicei prin reproducerea unui șoarece Cre la un șoarece loxP. Un șoarece Cre conține o transgenă de recombinază Cre sub direcția unui promotor specific țesutului; un șoarece loxP conține două site-uri loxP care flanchează un segment genomic de interes, locusul „floxat”. De obicei, șoarecii Cre și loxP sunt produși prin utilizarea tehnologiei transgenice (Nagy 2000). În funcție de promotori și alte controale de reglementare utilizate pentru a le construi, șoarecii Cre pot fi proiectați pentru a exprima recombinaza Cre numai în anumite condiții, inclusiv următoarele: în anumite țesuturi, atunci când dieta unui șoarece este suplimentată cu substanțe precum doxiciclină, tetraciclină, RU486 și tamoxifen (Brocard și colab. 1998; Kellendonk și colab. 1999; Utomo și colab. 1999) și în anumite etape de dezvoltare.
în funcție de locația și orientarea siturilor loxP într-un șoarece Cre-lox, recombinaza Cre poate iniția ștergeri, inversiuni și translocări ale locusului floxat (Nagy 2000) (Fig. 1).
Fig. 1.
reacțiile Cre-lox sunt afectate de orientarea și localizarea site-urilor loxP. Siturile loxp asociate (triunghiuri) au direcționalitate și pot fi plasate într-un aranjament cis (aceeași catenă ADN) sau trans (catene ADN diferite). (A) Dacă situsurile loxP flanchează un segment ADN (dreptunghi) într-un aranjament cis și sunt orientate în aceeași direcție, recombinaza Cre mediază excizia sau circularizarea segmentului. (B) dacă situsurile loxP flanchează segmentul ADN într-un aranjament cis și sunt orientate în direcții opuse, recombinaza Cre mediază inversarea segmentului. (C) dacă situsurile loxP sunt situate pe diferite catene de ADN și sunt orientate în aceeași direcție, recombinaza Cre mediază o translocare a segmentului.
de obicei, tulpinile Cre și loxP sunt dezvoltate independent și apoi încrucișate. Multe tulpini Cre diferite, fiecare conținând o transgenă Cre sub direcția unui promotor diferit specific țesutului, pot fi încrucișate cu o singură tulpină loxP. În funcție de tulpinile care sunt împerecheate, pot fi construite o varietate de sisteme model mediate de Cre, inclusiv transgenice, knockouts, hipomorfe, hipomorfe reparabile, aberante cromozomiale și mutanți induși de dietă. De fapt, prin amestecarea și potrivirea tulpinilor Cre și loxP, un investigator poate studia efectele unei gene în moduri specifice țesutului și în moduri specifice stadiului de dezvoltare care anterior erau imposibile.
sistemul FLP-FRT
sistemul FLP-FRT este similar cu sistemul Cre-lox și devine din ce în ce mai frecvent utilizat în cercetarea bazată pe șoarece. Aceasta implică utilizarea flippase (FLP) recombinaza, derivat din drojdie Saccharomyces cerevisiae (Sadowski 1995). FLP recunoaște o pereche de secvențe țintă de recombinază FLP (FRT) care flanchează o regiune genomică de interes.
Araki K, Imaizumi T, Okuyama K, Oike Y, Yamamura K. 1997. Eficiența recombinării prin expresia tranzitorie Cre în celulele stem embrionare: Compararea diferiților promotori. J Biochem (Tokyo) 122:977-82.
Brocard J, Feil R, Chambon P, Metzger D. 1998 o recombinază himerică Cre inductibilă de liganzi sintetici, dar nu naturali ai receptorului glucocorticoid. Acizi Nucleici Res 26: 4086-90.
note JAX. 1999. NIH, Laboratorul Jackson și DuPont Pharmaceuticals semnează acorduri de utilizare a tehnologiei Cre-lox. NOTE JAX 476: 4.
Kellendonk C, Tronche F, Reichardt HM, Schutz G. 1999. Mutageneza receptorului glucocorticoid la șoareci. J Steroizi Biochem Mol Biol 69: 253-9.
Nagy A. 2000. Cre recombinază: reactivul universal pentru adaptarea genomului. Geneza 26: 99-109.
Sadowski P. 1995. Recombinaza Flp a plasmidei de 2-centimm a Saccharomyces cerevisiae. Prog Acid Nucleic Res Mol Biol 51: 53-91.
Sauer B, Henderson N. 1988. Recombinarea ADN-ului specific Site-ului în celulele mamiferelor de către recombinaza Cre a bacteriofagului P1. Proc Natl Acad Sci U S A 85: 5166-70.
Sternberg N, Hamilton D. 1981. Bacteriofag P1 recombinare specifică site-ului. I. recombinarea între site-urile loxP. J Mol Biol 150:467-86.
Utomo AR, Nikitin AY, Lee WH. 1999. Controlul Temporal, spațial și specific tipului de celule al recombinării ADN mediate de Cre la șoarecii transgenici. Nat Biotehnol 17: 1091-6.