az elmúlt 30 év két legizgalmasabb és legsokoldalúbb genetikai eszköze a Cre-Lox és FLP-FRT technológiák. Mindkettő lehetővé teszi a génexpresszió helyének és időzítésének szoros szabályozását. Ez a cikk röviden bemutatja, hogyan működik a két rendszer, és használható egérmodellekben.
a CRE-lox rendszert
a Cre-lox technológiát az 1980-as években vezették be (Sauer and Henderson 1988; Sternberg and Hamilton 1981), és a DuPont Pharmaceuticals szabadalmaztatta. Sikeresen alkalmazták élesztőkben, növényekben, emlős sejttenyészetekben és egerekben (Araki et al. 1987). A P1 bakteriofág ciklizációs rekombinációs (Cre) rekombináz gén (cre) azon képességén alapul, hogy a loxp helyek párjai közötti rekombinációt befolyásolja. Az ilyen rekombináció egy “Cre-lox” egérben (lásd alább) aktiválhatja vagy inaktiválhatja az érdeklődő gént.
a CRE-lox technológia használatához a nyomozónak Cre-lox egeret kell előállítania, jellemzően egy Cre egér tenyésztésével loxP egérré. A Cre egér tartalmaz egy CRE rekombináz transzgént szövetspecifikus promóter irányítása alatt; a loxP egér két loxP helyet tartalmaz, amelyek az érdeklődésre számot tartó genomi szegmenst, a “floxed” lokuszt szegélyezik. Jellemzően a CRE és a loxP egereket transzgenikus technológiával állítják elő (Nagy 2000). Attól függően, hogy a promoterek és más szabályozó kontrollok használják őket, Cre egereket lehet tervezni, hogy kifejezzék Cre rekombináz csak bizonyos körülmények között, beleértve a következőket: bizonyos szövetekben, amikor az egér étrendjét olyan anyagokkal egészítik ki, mint a doxiciklin, a tetraciklin, a RU486 és a tamoxifen (Brocard et al. 1998; Kellendonk et al. 1999; Utomo et al. 1999) és bizonyos fejlődési szakaszokban.
a CRE-lox egér loxP helyeinek elhelyezkedésétől és tájolásától függően a CRE rekombináz képes a floxált lokusz törlését, inverzióját és transzlokációját kezdeményezni (Nagy 2000) (ábra. 1).
ábra. 1.
a Cre-lox reakciókat befolyásolja a loxP helyek tájolása és elhelyezkedése. A párosított loxP helyek (háromszögek) irányúak, és cisz (azonos DNS-szál) vagy transz (különböző DNS-szálak) elrendezésben helyezhetők el. (A) Ha a LOXP helyek cisz elrendezésben egy DNS-szegmenst (téglalapot) szegélyeznek, és ugyanabba az irányba vannak orientálva, a Cre rekombináz közvetíti a szegmens kivágását vagy cirkularizációját. B) Ha a LOXP-helyek cisz-elrendezésben szegélyezik a DNS-szegmenst, és ellentétes irányba vannak orientálva, a CRE rekombináz közvetíti a szegmens inverzióját. C) Ha a LOXP helyek a DNS különböző szálain helyezkednek el, és ugyanabba az irányba vannak orientálva, a Cre rekombináz közvetíti a szegmens transzlokációját.
általában a Cre és a loxP törzseket egymástól függetlenül fejlesztik, majd keresztezik. Számos különböző CRE törzs, amelyek mindegyike Cre transzgént tartalmaz egy másik szövetspecifikus promoter irányítása alatt, egyetlen loxp törzzsel keresztezhető. Attól függően, hogy mely törzsek párosodnak, különféle Cre-közvetített modellrendszerek építhetők fel, beleértve a transzgenikákat, kiütéseket, hipomorfokat, javítható hipomorfokat, kromoszóma-rendellenességeket és étrend-indukált mutánsokat. Valójában a CRE és a loxP törzsek keverésével és illesztésével a kutató tanulmányozhatja a gén hatásait szövetspecifikus és fejlődési szakasz-specifikus módon, amelyek korábban lehetetlenek voltak.
az FLP-FRT rendszer
az FLP-FRT rendszer hasonló a Cre-lox rendszerhez, és egyre gyakrabban használják az egér alapú kutatásokban. Ez magában foglalja az élesztőből származó flippáz (FLP) rekombináz alkalmazását Saccharomyces cerevisiae (Sadowski 1995). Az FLP felismer egy pár FLP rekombináz cél (FRT) szekvenciát, amelyek egy érdekes genomi régiót szegélyeznek.
Araki K, Imaizumi T, Okuyama K, Oike Y, Yamamura K. 1997. A rekombináció hatékonysága CRE tranziens expresszióval embrionális őssejtekben: különböző promoterek összehasonlítása. J Biochem (Tokió) 122:977-82.
Brocard J, Feil R, Chambon P, Metzger D. 1998 a glükokortikoid receptor szintetikus, de nem természetes ligandumai által indukálható kiméra Cre rekombináz. Nukleinsavak Res 26: 4086-90.
JAX jegyzetek. 1999. Az NIH, a Jackson Laboratory és a DuPont Pharmaceuticals CRE-lox technológiahasználati megállapodást írt alá. JAX MEGJEGYZÉSEK 476: 4.
Kellendonk C, Tronche F, Reichardt HM, Schutz G. 1999. A glükokortikoid receptor mutagenezise egerekben. J Szteroid Biochem Mol Biol 69: 253-9.
Nagy A. 2000. Cre rekombináz: az univerzális reagens a genom szabásához. Genezis 26: 99-109.
Sadowski P. 1995. A Saccharomyces cerevisiae 2-XXL plazmidjának Flp rekombináza. Prog Nukleinsav Res Mol Biol 51: 53-91.
Sauer B, Henderson N. 1988. Helyspecifikus DNS rekombináció emlős sejtekben a P1 bakteriofág Cre rekombinázjával. 85:5166-70.
Sternberg N, Hamilton D. 1981. Bakteriofág P1 helyspecifikus rekombináció. I. rekombináció a loxP helyek között. J Mol Biol 150: 467-86.
Utomo AR, Nikitin AY, Lee WH. 1999. A CRE által közvetített DNS rekombináció időbeli, térbeli és sejttípus-specifikus kontrollja transzgenikus egerekben. Nat Biotechnol 17:1091-6.